آموزش میکروبیولوژی عمومی (قسمت ۶)

آموزش میکروب عمومی

آموزش میکروب عمومی

Chapter 6 : Microbial Growth

هنگامی که  از رشد میکروبی صحبت می‌شود منظور افزایش تعداد سلول ها است نه افزایش اندازه‌ی آنها . تعداد میکروب‌های در حال رشد زیاد می‌شود و به صورت کلونی‌ها گرد هم جمع می‌شوند . کلونی، گروهی از سلول‌هاست که به اندازه‌ی کافی بزرگ هستند تا بتوان آنها را بدون میکروسکوپ مشاهده کرد.

کلاً برای رشد میکروبی، کلونی ها را در نظر می‌گیریم؛ چون هر کلونی از یک سلول باکتری به وجود می‌آید. تعداد میکروب‌ها را بر حسب CFU (Colony Forming Unit)  بیان می‌کنند.

The Requirements for Growth :

احتیاجات رشد میکروبی به دو دسته‌ی فیزیکی و شیمیایی تقسیم می‌شوند . عوامل فیزیکی شامل دما، pH و فشار اسمزی است . احتیاجات شیمیایی شامل منابع کربن، نیتروژن، گوگرد، فسفر، عناصر کمیاب، اکسیژن و نیز عوامل رشد آلی (مانند کوفاکتورها) می‌باشند .

Physical requirements :

احتیاجات فیزیکی رشد :

دما : بیشتر میکروارگانیسم‌ها در دماهایی که برای انسان‌ها مناسب هستند می‌توانند رشد خوبی داشه باشند. میکروارگانیسم ها بر اساس دامنه‌ی دمایی مورد علاقه‌ به سه دسته تقسیم می‌شوند :

  1. psychrophiles  یا میکروب های سرما دوست
  2. mesophiles یا میکروب‌هایی که دمای متعادل را دوست دارند
  3. Thermophiles یا میکروب‌های گرما دوست

بسیاری از باکتری‌ها در گسترده دمایی محدودی قادر به رشد هستند و اختلاف بیشترین دمایی که قادرند در آن رشد کنند با کمترین دما ، حدود ۳۰ درجه می‌باشد . این باکتری‌ها در دماهای بالاتر و پایین‌تر از دامنه‌ی دمایی خود ، رشد ضعیفی را از خود نشان می‌دهند . هر یک از گونه های باکتریایی در دماهای minimum , optimum & maximum خاصی رشد می‌کنند . دمای رشد Min ، پایین‌ترین دمایی است که گونه‌ی باکتری رشد خواهد کرد. دمای رشد optimum ، دمایی است که در آن دما باکتری بهترین رشد را داراست . دمای رشد Max نیز بالاترین دمایی است که باکتری‌ها قادرند در آن دما رشد کنند.

با رسم نمودار عکس العمل رشد در یک دامنه‌ی دمایی ، مشاهده می‌شود که دمای رشد بهینه معمولاً به قسمت بالایی دامنه‌ی دمایی نزدیک است و بالای دمای بهینه ، میزان رشد خیلی سریع کاهش می‌یاید. این مسئله احتمالاً به دلیل غیر فعال شدن سیستم‌های آنزیمی ضروری سلول در دماهای بالاست.

دامنه‌های دمایی رشد Max که باکتری‌ها را با عناوین  Psychrophile , Mesophiles & thermophiles مشخص می‌کنند ، به طور کامل معرفی نشده‌اند . به عنوان مثال psychrophileها اساساً به عنوان ارگانیسم‌هایی شناخته شدهاند که قادر به رشد در دمای صفر درجه می‌باشند. در حالیکه به نظر می‌رسد، دو گروه کاملاً متفاوت وجود دارند که قادر به رشد در این دما هستند . گروه اول ، phychrophileهایی هستند که می‌توانند در دمای صفر درجه رشد کنند، ولی دارای دمای رشد بهینه‌ی حدوداً ۱۵ درجه سلسیوس می‌باشند . بسیاری از این ارگانیسم‌ها به دماهای بالاتر از ۱۵ درجه بسیار حساسند؛ به طوری که حتی در یک اتاق نسبتاً گرم و با دمای ۲۵ درجه رشد نخواهند کرد . این‌ها عمدتاً در اعماق اقیانوس‌ها و نواحی قطبی یافت می‌شوند . این ارگانیسم‌ها به ندرت باعث بروز مشکل در نگهداری غذاها می‌شوند .

گروه دیگری که قادرند در دمای صفر درجه رشد کنند ، دارای دمای بهینه‌ی بالاتری حدود ۳۰-۲۰ درجه سانتی گراد هستند و در بالاتر از دمای حدوداً ۴۰ درجه نمی‌توانند رشد کنند . ارگانیسم‌های این نوع معمولتر از Psychrophileها هستند و احتمال دخالت و وجود داشتن آنها در فسادهای غذایی در دماهای پایین بیشتر است ؛ چراکه در دماهای یخچال به خوبی رشد می‌کنند . برای این دسته از میکروارگانیسم‌های فاسد کننده، لغت phychrotroph استفاده می‌شود . بسیاری از میکروبیولوژیست‌های زیست محیطی ترجیح می‌دهند به آنها moderate psychrophiles (متعادل) یا facultitaive psychrophiles (انتخابی) بگویند .

نگهداری در یخچال رایج‌ترین شیوه‌ی نگهداری غذاهای خانگی است . این مطلب بر اساس این است که سرعت تکثیر میکروبی در دماهای پایین کاهش می‌یابد . اگرچه میکروب‌ها معمولاً در دماهای انجماد هم زنده می‌مانند (ممکن است کاملاً به خواب فرو روند) ، اما به تدریج از تعدادشان کاسته می‌شود .

بعضی گونه ها سریعتر از بقیه رو به نزول می‌روند . در واقع psychrotroph ها نمی‌توانند در دماهای پایین به خوبی رشد کنند، مگر در مقایسه با سایر ارگانیسم‌هایی که قادر به رشد در این دماها نیستند . اینها قادرند به مرور زمان در دماهای پایین، به کندی غذاها را تجزیه کنند . این گونه فسادها می‌توانند به صورت میسیلیوم کپک، لزج شدن سطح غذا و ایجاد رنگ و مزه نامطلوب در غذاها ظاهر شوند . دمای داخل یخچال ، اگر به درستی تنظیم شده باشد ، می‌تواند سرعت رشد بسیاری از ارگانیسم‌های فاسد کننده را به طور چشمگیری کاهش داده یا حتی به طور کامل از رشد همه‌ی ارگانیسم‌ها ، به جز تعدادی از باکتری‌های بیماری‌زا ، جلوگیری کند .

مزوفیل‌ها با دمای رشد بهینه‌ی ۴۰-۲۵ درجه، رایج‌ترین نوع میکروب‌ها هستند . ارگانیسم‌هایی که به رشد در بدن حیوانات سازگار هستند ، دارای دمای رشد بهینه‌ای نزدیک به دمای رشد بهینه‌ی سلول‌های میزبان می‌باشند . دمای بهینه برای بسیاری از باکتری‌های بیماری‌زا، حدوداً ۳۷ درجه است و دستگاه‌های اینکوباتور برای کشت‌های کلینیکی، معمولاً در همین دما تنظیم می‌شوند . مزوفیل‌ها شامل بسیاری از ارگانیسم‌های رایجِ ایجاد کننده بیماری و فساد هستند .

ترموفیل‌ها، میکروارگانیسم‌هایی هستند که قادر به رشد در دماهای بالا می‌باشند . بسیاری از این ارگانیسم‌ها دمای رشد بهینه‌ی حدوداً ۶۰-۵۰ درجه دارند (حدود دمایِ آبِ لوله‌ی آبِ گرم). این دماها را می‌توان از خاکی که در معرض آفتاب است یا آبهای گرم ، مانند چشمه‌های آب گرم به دست آورد . معمولاً بسیاری از ترموفیل‌ها نمی‌توانند در دماهای پایین تر از دمای ۴۶ درجه رشد کنند .

آندوسپورهای که توسط باکتری‌های ترموفیل تشکیل می شوند به طور غیر طبیعی به گرما مقاومند و در فرآیندهای دمایی معمولی کنسروها، زنده می‌مانند . ترموفیل‌ها در کمپوست آلی بسیار با اهمیتند . در این کمپوست‌ها ، دما می‌تواند به سرعت تا ۶۰-۵۰ درجه سلسیوس افزایش یابد .

بعضی میکروب‌های زیرگروه آرکیاها دارای دمای بهینه‌ی رشد ۸۰ درجه و بالاتر هستند . به این ارگانیسم‌ها hyperthermophil یا extereme thermophile گفته می‌شود . بیشتر این ارگانیسم‌ها در چشمه‌های آب گرم مربوط به فعالیت‌های آتشفشانی زندگی می‌کنند. معمولاً در متابولیسم این‌ها، گوگرد اهمیّت دارد . رکورد شناخته شده برای رشد باکتریایی در دماهای بالا، حدود ۱۱۰ درجه سانتی‌گراد و نزدیک به منافذ هیدروترمال اعماق دریا می‌باشد .

pH :

pH به اسیدی یا قلیایی بودن یک محلول دلالت می‌کند . بسیاری از باکتری‌های بهترین رشد را در یک دامنه‌ی محدود pH ، نزدیک به pH خنثی، بین ۷٫۵-۶٫۵ دارند . تعداد خیلی کمی از باکتری‌ها در pH اسیدی پایین (۴= pH) می‌توانند رشد کنند . این مطلب دلیل آن است که تعدادی از غذاها مانند کلم شور تخمیری، ترشیجات و بسیاری از پنیرها از فساد با اسیدهای تولید شده از طریق تخمیر باکتریایی محافظت می‌شوند . با این وجود، بعضی از باکتریهایی که به آنها acidophile گفته می‌شوند ، معمولاً می‌توانند محیط اسیدی را تحمل کنند . یکی از انواع باکتری‌های chemoautotroph که در آب زاید حاصل از معادن زغال سنگ یافت می‌شود و گوگرد را برای تشکیل سولفوریک اسید اکسید می‌کند ، قادر است در pH برابر یک هم زنده بماند .

کپک‌ها و مخمرها در مقایسه با باکتری‌ها قادرند در گستره‌ی pH بزرگتری رشد کنند . اما pH بهینه‌ی کپک‌ها و مخمرها عموماً پایین‌تر از pH بهینه‌ی باکتری‌ها است (معمولاً حدود pH بین ۶-۵ ) . قلیایی شدن محیط نیز از رشد میکروب‌ها جلوگیری می‌کند ؛ اما به ندرت جهت حفاظت غذا از آن استفاده می‌شود .

وقتی باکتری‌ها در آزمایشگاه کشت داده می‌شوند، اغلب اسیدهایی تولید می‌کنند که در واقع در رشد خودشان دخالت می‌کند. برای خنثی کردن این اسیدها و نگه داشتن pH مناسب در محیط‌های رشد از بافرهای شیمیایی استفاده می‌شود . پپتون‌ها و اسیدهای آمینه در بعضی محیط‌ها نقش بافرها را دارند . در بسیاری از محیط‌ها از نمک‌های فسفاته هم استفاده می‌شود . فایده‌ی استفاده از نمک‌های فسفاته این است که تأثیر بافری خود را بر روی دامنه‌ی رشد pH بسیاری از باکتری‌های نشان می‌دهند . نمک‌های فسفاته سمّی نیستند و فسفر را که یک ماده‌ی ضروری است تأمین می‌کنند .

Osmotic Pressure :

فشار اسمزی :

میکروارگانیسم‌ها تقریباً همه‌ی مواد غذایی محلول را از آب اطراف خود می‌گیرند . بنابراین آنها برای رشدشان به آب احتیاج دارند ؛ نیز آنها ۹۰-۸۰ درصد از آب تشکیل شده‌اند . فشار اسمزی بالا باعث خروج آب ضروری از سلول می‌شود . وقتی سلول میکروبی در محلولی قرار دارد که غلظت حل شونده اش بالاتر از داخل سلول است (hypertonic) ، آب سلولی از طریق غشای پلاسمایی به سمت غلظت بالای حل شونده می‌رود و پلاسمولیز یا آب رفتن سیتوپلاسمم سلول اتفاق می‌افتد . اهمیّت این پدیده این است که وقتی غشای پلاسمایی از دیواره‌ی سلولی دور می‌شود، رشد سلول متوقف می‌شود . بنابراین افزودن نمک یا دیگر حل شونده‌ها به محلول و در نتیجه افزایش فشار اسمزی برای حفاظت غذاها استفاده می‌شود . ماهی نمک اندود شده و عسل تغلیظ شده‌ی خیلی شیرین با این مکانیسم محافظت می‌شوند .

غلظت‌های بالای نمک یا شکر، آب را از سلول میکروبی خارج می‌کنند و مانع از رشدشان می‌شوند . این تأثیرات فشار اسمزی مربوط به تعداد مولکول‌ها و یون‌های حل شده در یک حجم محلول است . بعضی ارگانیسم‌ها که extreme halophile گفته می‌شوند به غلظت‌های بالای نمک به خوبی سازگار شده‌اند که در واقع برای رشدشان به این شرایط نیاز دارند . در این حالت به آنها obligate halophile می‌گویند .

اگر فشار اسمزی به طور غیر طبیعی پایین باشد (hypotonic) –مثلاً در آب مقطر- آب تمایل به ورود به سلول دارد تا خروج از آن (تورژسانس) . بعضی میکروب‌ها که دیواره‌ی سلولی نسبتاً ضعیفی دارند با این فرآیند تجزیه می‌شوند .

Chemical Requirements :

احتیاجات شیمیایی :

کربن :

علاوه بر آب، یکی از مهم‌ترین احتیاجات برای رشد میکروبی کربن است . کربن اسکلت ساختمانی مواد زنده است . کربن برای همه ی ترکیبات آلی که تشکیل دهنده‌ی سلول زنده‌اند لازم است . نصف ماده‌ی خشک کالبدِ یک سلول باکتریایی معمولی، کربن است . chemohetrotrophها بیشتر کربن مورد نیازشان را از منبع انرژی خود می‌گیرند (مواد آلی شامل پروتئین‌ها ، کربوهیدرات‌ها و لیپید‌ها). Chemoautotrophها و photoautotrophها کربن را از دی اکسید کربن استخراج می‌کنند .

نیتروژن ، گوگرد و فسفر :

علاوه بر کربن، عناصر دیگری هم برای سنتز مواد سلولی توسط میکروارگانیسم‌ها لازم است . برای مثال ، سنتز پروتئین به مقادیر قابل ملاحظه‌ی نیتروژن و به همان میزان گوگرد نیاز دارد . سنتز DNA و RNA نیز همانند سنتز ATP که مولکولی مهم در ذخیره و انتقال انرژی در سلول است ، محتاج وجود نیتروژن و مقداری فسفر می‌باشد .

نیتروژن ۱۴ درصد ماده‌ی خشک سلول باکتری و گوگرد و فسفر با هم ۴ درصد ماده‌ی خشک را تشکیل می‌دهند . ارگانیسم‌ها از نیتروژن برای تشکیل گروه آمینی آمینواسیدهای پروتئین‌ها استفاده می‌کنند. بسیاری از باکتری‌ها این نیاز را از طریق تجزیه‌ی مواد حاوی پروتئین و شرکت دادن آمینواسیدهای حاصل در پروتئین‌های تازه سنتز شده و ترکیبات حاوی نیتروژن دیگر ، تأمین می‌کنند . بقیه‌ی باکتری‌ها از نیتروژنِ یون‌های آمونیوم بهره می‌جویند .

بعضی از باکتری‌های مهم، شامل بسیاری از سیانوباکتری‌های فتوسنتز کننده، از گاز نیتروژن اتمسفر به طور مستقیم استفاده می‌کنند . به این فرآیند، تثبیت نیتروژن گفته می‌شود . بعضی ارگانیسم‌ها که می‌توانند از این روش استفاده کنند، زندگی آزاد دارند و بیشتر در خاک یافت می‌شوند ؛ اما بقیه‌ی آنها ، با ریشه‌ی بقولات همزیستی (symbiosis) دارند . بقولات شامل میخک، سویا، لوبیا، نخود و یونجه هستند .

 منابع طبیعی مهم گوگرد شامل یون سولفات ()، هیدروژن سولفید و آمینو اسیدهای گوگرد دار هستند .

فسفر برای سنتز نوکلئیک اسیدها و فسفولیپیدهای غشاهای سلول ضروری است . فسفر در پیوندهای انرژی ATP یافت می‌شود . یک منبع مهم فسفر ، یون فسفات است . پتاسیم، منیزیم و کلسیم از عناصری هستند که میکروارگانیسم ها احتیاج دارند واغلب به صورت کوفاکتورها برای آنزیم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند .

Trace Elements :

عناصر کمیاب :

میکروب‌ها به مقادیر خیلی کم سایر عناصر معدنی شامل آهن، مس، مولیبدنوم (molybdenum) و روی را احتیاج دارند . به این عناصر، عناصر کمیاب می‌گویند . بیشتر این مواد به عنوان کوفاکتورها برای عملکرد آنزیم‌های مشخص ضروری‌اند . اگرچه این عناصر معمولاً به محیط کشت‌های آزمایشگاهی اضافه می‌شوند، اما اینگونه فرض می‌شود که این عناصر به طور طبیعی در آبِ شیر آبی و دیگر ترکیبات واسطه موجودند . حتی بیشتر آب‌های تقطیر شده حاوی مقادیری از این مواد هستند ، اما این عناصر کمیاب مطمئناً در آب شیر آبی وجود دارند .

Oxygen :

ما عادت کرده‌ایم اینگونه فکر کنیم که مولکول اکسیژن برای زندگی کردن ضروری است  ، اما این گاز در حقیقت یک گاز سمی است . در حقیقت در اکثر اوقات تاریخچه‌ی زمین ، مولکول‌های بسیار ریز اکسیژن در اتمسفر وجود داشته‌اند . در واقع ممکن است زندگی  بدون حضور اکسیژن نمی‌توانسته وجود داشته باشد . به هر حال بسیاری از اشکال زندگی دارای سیستم‌های متابولیکی محتاج به اکسیژن برای انجام تنفس هوازی می‌باشند . همانگونه که مشاهده می‌کنیم ، اتم‌های هیدروژن که به وسیله ارگانیسم‌ها به دام افتاده‌اند، با اکسیژن ترکیب شده و تولید آب می‌کنند . این پروسه هنگام تبدیل گاز سمی اکسیژن به ترکیب تمیز آب ، مقدار قابل توجهی انرژی تولید می‌کند .

 میکروب‌هایی که از مولکول اکسیژن استفاده می‌کنند (aerobes)، انرژی بیشتری را از مواد غذایی نسبت به میکروب‌هایی که از اکسیژن استفاده نمی‌کنند (anaerobes) تولید می‌کنند . ارگانیسم‌هایی که برای زندگی به اکسیژن نیاز دارند را هوازی اجباری (Obligate aerobes) گوییم . میکروب‌های هوازی اجباری در وضع نامساعدی به سر می‌برند ؛ چون اکسیژن خیلی کم در آب محیط‌شان محلول است. بنابراین بسیاری از باکتری‌های هوازی توانایی ادامه‌ی رشد در غیاب اکسیژن را پیدا کرده‌اند . به این ارگانیسم‌ها غیرهوازی اختیاری (facultative anaerobes) گویند . به عبارت دیگر، باکتری‌های غیر هوازی اختیاری زمانی که اکسیژن وجود دارد از آن استفاده می‌کنند ، ولی وقتی که اکسیژن در دسترس نیست با استفاده از تخمیر یا تنفس بی هوازی به رشد خود ادامه می‌دهند . با این وجود، بازده‌ی تولید انرژی آنها در غیاب اکسیژن کاهش می‌یابد. مثال‌های facultative acaerobies ، باکتری E-coli که در دستگاه گوارش انسان وجود دارد و نیز بسیاری از مخمرهاست . باکتری‌های غیر هوازی اجباری (obligate anaerobes) باکتری‌هایی هستند که نمی‌توانند از اکسیژن برای واکنش‌های تولید انرژی استفاده کنند . در واقع این باکتری‌ها توسط اکسیژن آسیب می‌بینند. مثال این نوع از باکتری‌ها، جنس کلستریدیوم است که عامل کزاز و بوتولیسم می‌باشد. این باکتری‌ها از اتم‌های اکسیژن که در مواد سلولی وجود دارند استفاده می‌کنند؛ این اتم‌ها معمولاً از آب نشأت می‌گیرند .

فرم‌های سمی اکسیژن عبارتند از :

  1. singlet oxygen  که همان مولکول طبیعی اکسیژن است که به سطح بالایی از انرژی برده شده و بسیار فعال است . این مولکول در سلول‌های فاگوسیت کننده که نقش مهمی در مقابله‌ی بدن در مقابل پاتوژن‌هایی همچون باکتری‌ها دارند ، وجود دارد . یکی از این سلول‌های فاگوسیت باکتری را احاطه کرده و در واقع آن را قورت می‌دهد و پس از آن ، آنها را در معرض این نوع اکسیژن قرار داده و موجب مرگ آنها می‌شود.
  2.  رادیکال‌های آزاد سوپر اکسید ()

SOD (SuperOxide Dismutase) آنزیمی است که برای خنثی کردن سمیّت  استفاده می‌شود:

     ۳٫   آنیون پراکسید () که در  وجود دارد و سمی است . هیدروژن پراکسیدی که طی تنفس هوازی معمولی تولید می‌شود، سمی است؛ بنابراین میکروب‌ها از آنزیم‌هایی برای خنثی کردن آن استفاده می‌کنند. معروفترین آنزیمی که استفاده می‌شود، آنزیم کاتالاز است که  را تبدیل به آب و اکسیژن می‌کند .

کاتالاز از طریق عملکردش روی هیدروژن پراکسید به راحتی تشخیص داده می‌شود. وقتی که به کلونی‌هایی که آنزیم کاتالاز تولید می‌کنند، یک قطره هیدروژن پراکسید اضافه کنیم ، حبابب‌های اکسیژن آزاد می‌شوند.

آنزیم دیگری که هیدروژن پراکسید را تجزیه می‌کند ، آنزیم پراکسیداز است که با آنزیم کاتالاز از این نظر که تولید اکسیژن نمی‌کند متفاوت است .

    ۴٫  رادیکال‌ هیدروکسیل () فرم حدواسط اکسیژن است .

     باکتری‌های بی‌هوازی اجباری معمولاً هیچکدام از آنزیم‌های کاتالاز و SOD را تولید نمی‌کنند . چون شرایط هوازی ممکن است منجر به تجمع رادیکال‌های آزاد سوپر اکسید در سیتوپلاسم شود . باکتری‌های بی‌هوازی اجباری نسبت به اکسیژن بسیار حساسند .

Aerotolerant anaerobes باکتری‌هایی هستند که نمی‌توانند از اکسیژن برای رشدشان استفاده کنند، ولی می‌توانند به خوبی وجود اکسیژن را تحمّل کنند . یک مثال رایج باکتری‌های مذکور که می‌توانند لاکتیک اسید تولید کنند، Lacto bacillic  است که برای تولید بسیاری از غذاهای تخمیری اسیدی مانند ترشیجات و پنیر استفاده می‌شود . در آزمایشگاه، این باکتری‌ها مانند سایر باکتری‌ها نگهداری و رشد داده می‌شوند ؛ ولی از اکسیژن موجود در هوا هیچ استفاده‌ای نمی‌کنند . این باکتری‌ها قادر به تحمل اکسیژن هستند؛ چون دارای آنزیم SOD یا هر سیستمی که بتواند فرم‌های سمی اکسیژن را خنثی کند، می‌باشند .

تعدادی از باکتری‌ها micro aerophile هستند که هوازی‌اند و از اکسیژن استفاده می‌کنند. این باکتری‌ها در غلظت اکسیژن پایین‌تر از هوا می‌توانند رشد کنند . در یک لوله‌ی آزمایش محیط کشت جامد، این باکتری‌ها فقط قادر به رشد در عمق هستند که مقادیر کمی اکسیژن به آنجا منتشر شده است . این‌ها در مکان‌هایی که به سطوح غنی از اکسیژن نزدیکند یا پایین ناحیه‌ی باریکی که اکسیژن کافی وجود دارد ، نمی‌توانند رشد کنند .

Organic Growth Factors :

فاکتورهای آلی رشد :

به ترکیبات آلی ضروری که ارگانیسم‌ها نمی‌توانند آنها را سنتز کنند و باید مستقیماً از محیط شان دریافت کنند، فاکتورهای آلی رشد می‌گویم . یک گروه از این فاکتورها  ، ویتامین‌ها هستند . بیشتر ویتامین‌ها به عنوان کوآنزیم‌ها عمل می‌کنند . کوآنزیم‌ها ، کوفاکتورهای آلی هستند که آنزیم ها برای عملکردشان به آنها احتیاج دارند . بسیاری از باکتری‌ها می‌توانند ویتامین‌های خود را بسازند و وابسته به منابع خارجی نیستند. با این وجود، بعضی باکتری‌ها فاقد آنزیم‌های مورد نیاز برای سنتز ویتامین‌ها هستند و برای این باکتری‌ها، ویتامین‌ها ، فاکتورهای آلی رشد هستند .

از جمله فاکتورهای آلی رشد دیگری که باکتری‌ها نیاز دارند می‌توان آمینواسیدها ، پورین‌ها و پیریمیدین‌ها را نام برد .

Culture Media :

محیط کشت :

به آن ماده‌ی غذایی که در آزمایشگاه برای رشد میکروارگانیسم‌ها تهیه می‌شود ، محیط کشت می‌گوییم . بعضی باکتری‌ها می‌توانند در هر محیط کشتی به خوبی رشد کنند . بعضی دیگر احتیاج به محیط‌های مخصوص دارند و بعضی در هیچ محیط کشت غیر زنده‌ای که تا بحال ایجاد شده‌اند، نمی‌توانند رشد کنند .

وقتی میکروبها را وارد محیط کشت می‌کنیم تا رشد خود را آغاز کنند، به آنها inoculum می‌گوییم. به میکروب‌هایی که درون و یا روی محیط کشت رشد می‌کنند و تعدادشان زیاد می‌شود culture  می‌گوییم.

وقتی که کشت دادن باکتری در محیط کشت جامد مورد نظر است، یک عامل جامد کننده مانند آگار به محیط اضافه می‌کنیم . آگار یک پلی ساکارید پیچیده است که از یک جلبک دریایی مشتق می‌شود. مدتهاست از آگار به عنوان قوام دهنده در غذاها استفاده می‌شود ؛ مانند ژله‌ها و بستنی .

آگار دارای ویژگی‌های مهمی است که آن را در میکروبیولوژی ارزشمند می‌کند و تا به حال هیچ جانشین مناسبی برای آن یافت نشده است . تعداد بسیار اندکی می‌توانند آگار را تجزیه کنند ، بنابراین آگار جامد باقی می‌ماند . آگار در دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد مایع می‌شود (نقطه‌ی جوش آب) و در سطح دریا مایع باقی می‌ماند تا زمانی که دما به ۴۰ درجه می‌رسد . برای استفاده‌های آزمایشگاهی ، آگار در حمام‌های بخار در دمای ۵۰ درجه نگه داشته می‌شود . در این دما، هنگام ریختن آگار روی باکتری‌ها ،آگار به بیشتر باکتری‌ها صدمه نمی زند. وقتی آگار جامد می‌شود، می‌توان در دماهای نزدیک ۱۰۰ درجه، قبل از دمایی که مایع شود ، در اینکوباتور نگه داشت . این ویژگی مخصوصاً زمانی که باکتری‌های ترموفیل در حال رشد هستند ، بسیار مفید است . محیط آگار معمولاً در لوله‌های آزمایش یا پتری دیش نگه داشته می‌شوند .

به لوله‌های آزمایشی که آگار آنها در گوشه‌ای جامد شده و یک سطح وسیع برای رشد فراهم آورده است ، Slant می‌گوییم . وقتی آگار در یک لوله ی عمودی جامد می‌شود ، به آن deep می‌گوییم .

Chemically Defined Media :

محیط کشتی است که ترکیب دقیق شیمیایی آن مشخص است . برای یک کموهتروتروف ، این نوع محیط کشت باید حاوی فاکتور‌های آلی رشد باشد که نقش منبع کربن و انرژی را ایفا می‌کند . در محیط کشت کموهتروتروف E-coli ، حتماً باید گلوکز وجود داشته باشد . به ارگانیسم‌هایی که به بسیاری از فاکتورهای رشد نیاز دارند ، fastidious (نازک نارنجی) گفته می‌شود . از این نوع ارگانیسم‌ها مانند Lacto bacillus ، گاهی اوقات در آزمایش‌هایی که غلظت یک ویتامین مشخص را معیّن می‌کنند، استفاده می‌شود .

Complex Media :

Chemically Defined Media معمولاً مختص کارهای آزمایشگاهی یا برای رشد باکتری‌های اتوتروف است . بسیاری از باکتری‌های هتروتروف و قارچ‌ها ، مانند آنهایی که در واحد آزمایشگاه مقدماتی به کار برده می‌شوند، در Complex Media رشد می‌کنند که شامل مواد غذایی مانند مواد خارج شده از مخمر‌ها ، گوشت، گیاهان یا مشتقات این منابع یا دیگر منابع است .

ترکیب دقیق شیمیایی به مقدار کمی از یک تولید به تولید دیگر متفاوت است . در complex Media احتیاجات انرژی ، کربن ، نیتروژن و گوگرد میکروارگانیسم‌های در حال رشد، عمدتاً با پروتئین تأمین می‌شود . پروتئین یک مولکول بزرگ، نسبتاً غیر قابل حل است که فقط تعداد کمی از میکروارگانیسم‌ها می‌توانند به طور مستقیم از آن استفاده کنند؛ ولی برخی از مشتقات اسیدها و آنزیم‌ها، پروتئین‌ها را به زنجیره‌های آمینواسیدی کوتاهتری به نام پپتون (peptone) تجزیه می‌کنند . این اجزای کوچک و قابل حل می‌توانند توسط بیشتر باکتری‌ها گوارش یابند .

ویتامین‌ها و بقیه‌ی فاکتورهای آلی رشد توسط مواد استخراج شده از گوشت و مخمر تأمین می‌شوند . ویتامین‌ها و مواد معدنی قابل حل حاصل از گوشت‌ها و مخمر‌ها در عصاره‌ی آنها (extracting water) حل شده و سپس آب تبخیر می‌شود و در نتیجه این فاکتورها تغلیظ می‌شوند . (این مشتقات به ترکیبات آلی نیتروژن و کربن اضافه می‌شوند) . مشتقات مخمر‌ها به طور ویژه‌ای غنی از ویتامین‌های B هستند .اگر complex media به فرم مایع باشد ، Nutrient broth گفته می‌شود . وقتی به Nutrient broth ، آگار اضافه کنیم ، به محیط حاصل Nutrient Agar  می‌گوییم . (با این اصطلاح ممکن است دچار اشتباه شوید، فقط به یاد داشته باشید که آگار به تنهایی یک ماده‌ی غذایی نیست .)

Anaerobic Growth Media and Methods :

محیط رشد بی هوازی و روش‌ها :

کشت باکتری‌های بی‌هوازی باعث یک مشکل خاص می‌شود . چون باکتری‌های بی‌هوازی ممکن است با در معرض اکسیژن قرار گرفتن کشته شوند ، باید از محیط ویژه‌ای به نام Reducing media  استفاده کنیم . این محیط ها دارای موادی مانند سدیم تیوگلیکولات (sodium thioglycolate) هستند که به طور شیمیایی با اکسیژن قابل حل ، ترکیب می‌شوند و اکسیژن را از محیط کشت خارج می‌کنند. در یک تکنیک نسبتاً جدید برای تأمین محیط بی هوازی از یک آنزیم به نام Oxyrase استفاده می‌شود که اکسیژن را به آب احیا می‌کند . Oxyrase یک آنزیم تنفسی است که از غشاهای پلاسمایی باکتری‌های خاصی ناشی می‌شود . وقتی که این آنزیم را به محیط رشد اضافه می‌کنیم ، Petri plate و Oxy plate به یک محفظه‌ی بی هوازی خودکفا تبدیل می‌شوند . این روش که نیاز به دستگاه‌های مشکل و دست و پا گیر را برطرف می‌کند ، اکنون به طور وسیعی در آزمایشگاه‌ها استفاده می‌شود .

Selective and Differential Media :

Selective media برای متوقف کردن رشد باکتری‌های ناخواسته و تحریک رشد میکروب‌های مورد نظر طراحی شده است . به عنوان مثال bismuth sulfite Agar محیطی است که برای جداسازی باکتری typhoid  (عامل تیفوس) و Salmonella typhi (که گرم منفی است) ، از مدفوع استفاده می‌شود .

بیسموت سولفیت، مانع از رشد باکتری‌های گرم مثبت و بسیاری از باکتری‌های گوارشی گرم منفی (به جز S.typhi ) می‌شود . رنگ‌هایی مانند brilliant green (bg) به طور انتخابی مانع رنگ شدن باکتری‌های گرم مثبت می‌شود و این رنگ اساس محیطی به نام brilliant green agar است که برای جداسازی سالمونلای گرم منفی استفاده می‌شود .

Differential media ، تشخیص کلونی‌های ارگانیسم مورد نظر از سایر کلونی‌هایی که در پلیت مشابه رشد کرده اند را آسان می‌کند .

Blood agar که حاوی گلبول‌های قرمز خون است محیطی است که برای تشخیص گونه‌های باکتریایی تخریب کننده گلبول‌های قرمز خون استفاده می‌شود . این گونه‌ها مانند Streptococcus pyogenes که عامل ناراحتی گلو است ، پس از کشت ، حلقه‌های شفافی را اطراف کلونی‌هایشان ایجاد می‌کنند .

گاهی اوقات خصوصیات selective و differential در یک محیط ترکیب می‌شوند . فرض کنید که می‌خواهیم باکتری رایج استافیلوکوکوس اورئوس را که در ترشحات بینی وجود دارند جداسازی کنیم . این ارگانیسم می‌تواند غلظت‌های بالای سدیم کلرید را تحمل کند ، همچنین می‌تواند کربوهیدرات مانیتول را برای تشکیل اسید، تخمیر کند . Manitol salt Agar  حاوی ۵/۷ درصد سدیم کلرید است که می‌تواند رشد ارگانیسم‌های رقیب را کاهش دهد و در نتیجه رشد S.aureus را تسهیل می‌کند . این محیط نمکی، یک شناساگر pH نیز دارد که وقتی مانیتول محیط به اسید تخمیر می‌شود ، رنگش تغییر می‌کند . کلونی‌های S.aureus که توانایی تخمیر مانیتول را دارند از سایر کلونی‌هایی که این توانایی را ندارند متمایز می‌شوند . باکتری‌هایی که در غلظت‌های بالای نمک رشد می‌کنند و مانیتول را به اسید تخمیر می‌کنند، به آسانی با تغییر رنگ تشخیص داده می‌شوند . این باکتری‌ها احتمالاً کلونی‌های  S.aureus هستند که تشخیص آنها با آزمایشات اضافی انجام می‌شود .

Enrichment Culture :

چون باکتری‌هایی که تعدادشان کم است ، ممکن است از دست بروند، مخصوصاً اگر باکتری‌های دیگری که موجودند، تعدادشان بیشتر باشد، ضروری است که از enrichment culture استفاده شود . از این محیط اغلب برای نمونه‌های مدفوع و خاک استفاده می‌شود . این محیط برای کشت  enrichment ، معمولاً مایع است و مواد غذایی و شرایط محیطی مناسب برای رشد میکروب‌های مخصوص ، اما نه بقیه‌ی میکروب‌ها را تأمین می‌کند . از این لحاظ ، این نوع محیط یک نوع محیط انتخابی است ؛ ولی این محیط برای افزایش تعدادهای اندک ارگانیسم مورد نظر تا سطح قابل تشخیص طراحی شده است .

Obtaining Pure Cultures :

به دست آوردن کشت‌های خالص :

بیشتر مواد عفونی مانند pus (چرک زخم و غیره) ، sputum (خلط) و urine (ادرار) همانند نمونه‌های خاک، آب و غذا حاوی انواع متفاوت باکتری‌ها هستند . اگر این مواد را بر روی سطح محیط جامد بکشیم، کلونی‌هایی تشکیل می‌شوند که نسخه‌های دقیق ارگانیسم اصلی هستند . یک کلونی مرئی ، از نظر تئوری ، از یک اسپورِ تک یا سلول رویشی یا از گروهی از میکروارگانیسم‌های مشابه که به فرم‌های خوشه‌ای (clumps) یا زنجیره‌ای (chains) به یکدیگر متصل شده‌اند ، به وجود می‌آید . بسیاری از کارهای باکتری شناسی به کشت‌های خالص یا کلونی‌های باکتری‌ها نیاز دارند . روش جداسازی بسیار رایج که برای به دست آوردن کشت‌های خالص استفاده می‌شود ، Streak plate method می‌باشد . یک لوپ تلقیحی استریل را وارد کالچری مخلوطی که حاوی بیش از یک نوع میکروب است کرده و طبق الگو بر روی سطح Nutrient Medium ، به صورت خط خطی می‌کشیم . وقتی که الگو را دنبال کنیم، باکتری‌ها از لوپ روی محیط انتقال می‌یابند . سلول‌های آخری که از لوپ وارد محیط می‌شوند ، به اندازه‌ی کافی از یکدیگر دور هستند که بتوانند به صورت کلونی‌های جدا از هم رشد کنند .

این کلونی‌های را می‌توان با inoculating loop برداشت و به لوله‌های آزمایش Nutrient Medium منتقل کرد تا کشت‌هایی خالص شامل فقط یک نوع باکتری تولید شوند .

(برای شمارش کلونی‌ها از pour plate و spread plate استفاده می‌شود . از pour برای باکتری‌های هوازی و غیر هوازی ، ولی از spread فقط برای باکتری‌های هوازی استفاده می‌شود .)

Preserving Bacterial Culture :

نگهداری کشت‌های باکتریایی :

از یخچال می‌توان برای نگه داشتن کوتاه مدت کشت های باکتریایی استفاده کرد . دو روش رایج برای نگهداری بلند مدت کشت های میکروبی عبارتند از : deep freezing و lyophilization .

Deep freezing فرآیندی است که طی آن، کشت خالص میکروب‌ها را در یک مایع سوسپانسیون کننده و سریع منجمد شونده در دامنه‌ی دمایی ۵۰- تا ۹۵- درجه سلسیوس قرار می‌دهیم . کالچر حتی پس از چندین سال قادر است پس از انجماد زدایی، کشت داده شود .

در lyophilization یا freeze drying (خشک کردن تصعیدی) ، یک سوسپانسیون میکروب‌ها خیلی سریع در دامنه‌ی دمایی ۵۴- تا ۷۲- درجه سانتی گراد منجمد می‌شود ، سپس آب آن با قرار گرفتن در شرایط خلأ شدید (high vaccum) گرفته می‌شود . هنگامی که تحت خلأ است ، محفظه با ذوب کردن شیشه با شعله‌ی بسیار داغ بسته می شود . باقی مانده‌ی پودر مانند که حاوی میکروب‌های زنده مانده است، میتواند سالها نگهداری شود .

The Growth of Bacterial Cultures :

رشد کشت‌های باکتریایی :

توانایی تعیین تعداد میکروب‌ها به صورت مستقیم (با شمارش) یا غیر مستقیم (با اندازه‌گیری فعالیتهای متابولیکی آنها) ضروری است .

Bacterial Division :

تقسیم باکتریایی :

رشد باکتریایی به معنی افزایش تعداد باکتری‌هاست نه افزایش اندازه ی آنها . به طور طبیعی باکتری‌ها با تقسیم دوتایی (binary fission) تکثیر می‌یابند .

تعداد کمی از گونه‌های باکتریایی با جوانه زدن (budding) تکثیر می‌شوند . آنها یک جوانه ی کوچک ابتدایی را به وجود می‌آورند و تا وقتی که به اندازه ی سلول مادری برسد ، بزرگ می‌شود و سپس جدا می‌شود . (در مخمر‌ها از جوانه زدن استفاده می‌شود .)

Generation Time :

به مدت زمانی که لازم است تا یک سلول تقسیم شود و جمعیت آن دو برابر شود،generation time(gt) گفته می‌شود . این زمان بسته به نوع ارگانیسم و شرایط محیطی مانند دما، به طور قابل ملاحظه‌ای متفاوت است . اگر دو برابر شدن جمعیت هر ۲۰ دقیقه یکبار انجام شود (مانند باکتری E-coli در شرایط مساعد) بعد از ۲۰ gt یک سلول ابتدایی به بیشتر از یک میلیون سلول تبدیل می‌شود .

Phases of Growth :

فازهای رشد :

وقتی تعدادی از باکتری‌ها در محیط کشت مایع تلقیح شدند و جمعیت آنها در فواصل مختلف شمارش شد، می‌توانیم منحنی رشد باکتریایی را که نشان دهنده‌ی رشد سلول‌ها در طول زمان است رسم کنیم . چهار فاز اصلی رشد وجود دارد : lag , log , stationary & death

The lag phase :

برای مدت کمی، تعداد سلول‌ها خیلی کم تغییر می‌کند ؛ چون سلول‌ها نمی‌توانند فوراً در یک محیط جدید تکثیر یابند . این دوره که در آن هیچ تقسیم سلولی انجام نمی‌شود یا خیلی کم است ، lag phase گفته می‌شود و می‌تواند یک ساعت یا چندین روز طول بکشد .

در طی این مدت، سلول‌ها در حالت خواب نیستند . جمعیت میکروبی دستخوش یک دوره‌ی فعالیت‌های متابولیکی شدید می‌شود که مخصوصاً شامل سنتز آنزیم‌ها و مولکول‌های متفاوت است .

The Log Phase :

در واقع سلول‌ها شروع به تقسیم می‌کنند و وارد دوره‌ای از رشد یا افزایش لگاریتمی می شوند که به آن Log phase یا exponential growth phase (تصاعدی) گفته می شود . تکثیر سلولی، فعالترین حالت خود را در این دوره دارد و generation time به حداقل ثابت می رسد . چون gt ثابت است، منحنی لگاریتمی رشد در این فاز یک خط صاف است . log phase زمانی است که سلول‌ها از نظر متابولیکی فعالترین حالت را دارند و برای اهداف صنعتی (مثالاً وقتی که می‌خواهیم یک محصول را با بازده تولید کنیم) ترجیح داده می‌شوند . البته طی فاز log ، میکروارگانیسم‌ها به طور ویژه ای به شرایط نامساعد حساس هستند . تشعشع و بسیاری از داروهای ضد میکروبی (مثلاً آنتی بیوتیک پنی سیلین) اثر خود را با دخالت در برخی از مراحل مهم فرآیند رشد اعمال می‌کنند و بدین طریق، طی این فاز برای سلول‌ها بسیار مضر هستند .

The Stationary Phase :

در واقعیت رشد لگاریتمی سلول‌ها ، آنگونه که شروع می‌شود ، ادامه پیدا نمی‌کند و سرعت رشد کاهش می یابد و تعداد مرگ‌های میکروبی، تعداد سلول‌های جدید را متعادل می‌کند و جمعیت متوازن می‌شود. در این فاز ، فعالیت‌های متابولیکی سلول‌های باقی‌مانده نیز کاهش می یابد . به این دوره‌ی تعادلی، Stationary phase گفته می‌شود . عواملی که باعث توقف رشد لگاریتمی می‌شوند همیشه مشخص نیست . تمام شدن مواد غذایی ، تجمع محصولات دفعی و تغییر مضر در pH ، همگی می‌توانند این نقش را ایفا کنند و باعث توقف رشد لگاریتمی شوند . در یک دستگاه تخصصی به نام chemostat یک جمعیت در فاز رشد لگاریتمی نگه داشته می شود . به طور نامحدود از طریق خارج کردن محیط مصرف شده و افزودن محیط تازه این کار انجام می شود . این نوع کشت پیوسته (مداوم) در تخمیر‌های صنعتی استفاده می‌شود .

The Death phase :

در این فاز تعداد مرگ‌ها از تعداد سلول‌های تازه تشکیل شده بیشتر می شود و جمعیت وارد death phase یا logarithmic decline (فاز نزول لگاریتمی) می‌شود . این فاز ادامه پیدا می‌کند تا زمانی که سلول به جزء کوچکی از سلول‌های فاز قبلی کاسته شوند یا کل جمعیت سلولی از بین برود .

Direct Measurement of Microbial Growth :

اندازه‌گیری مستقیم رشد میکروبی :

رشد جمعیت‌های میکروبی به وسیله‌ی تعدادی از روش‌ها اندازه‌گیری می‌شود . بعضی روش ها تعداد سلول‌ها را اندازه می‌گیرند . روش‌های دیگری حجم کل جمعیت را اندازه می‌گیرند که اغلب به طور مستقیم با تعداد سلول‌ها متناسب است . تعداد جمعیت معمولاً به صورت تعداد سلول‌ها در میلی لیتر مایع یا گرم ماده‌ی جامد ثبت می‌شود ؛ چراکه جمعیت‌های باکتریایی معمولاً خیلی بزرگ هستند . بیشتر روش‌های شمارش آنها بر اساس شمارش مستقیم یا غیر مستقیم نمونه‌های خیلی کوچک است . سپس محاسبات اندازه‌ی کل جمعیت را تعیین می‌کنند . به عنوان مثال ، فرض کنید در  شیر ترش شده ، ۷۰ سلول باکتریایی وجود دارد ؛ بنابراین باید ۷۰ میلیون سلول باکتریایی در ۱ml وجود داشته باشد . اگرچه اندازه‌گیری   مایع یا  غذا کاربردی نیست . بنابراین ، این روش به صورت غیر مستقیم ، در یک سری رقیق سازی انجام می‌شود .

Plate Counts :

متداول‌ترین روش اندازه‌گیری جمعیت باکتریایی ، Plate count است . یکی از فواید مهم این روش این است که تعداد سلول‌های زنده را اندازه می‌گیرد . یکی از نقاط ضعف این روش هم آن است که مدت زمان زیادی لازم دارد تا کلونی‌های مرئی تشکیل شوند . (معمولاً ۲۴ ساعت یا بیشتر) در plate count تصور می‌شود که هر باکتری زنده رشد می‌کند و تقسیم می‌شود تا یک کلونی تکی تولید کند . این مطلب همیشه درست نیست؛ چون باکتری‌ها اغلب به صورت متصل به هم و به فرم‌های زنجیره‌ای و خوشه ای رشد می‌کنند . بنابراین، یک کلونی اغلب نه از یک باکتری تک ، بلکه از قسمت کوتاهی از یک زنجیره‌ یا خوشه‌های باکتریایی حاصل می‌شود . برای نشان دادن این واقعیت ، plate counts اغلب به صورت colony forming units (CFU) بیان می شوند .

بر اساس توافق‌نامه‌ی Food & Drug Administration ، فقط پلیت‌های حاوی ۲۵۰-۲۵ کلونی شمارش می شوند ؛ ولی بسیاری از میکروبیولوژیست‌ها پلیت‌هایی با ۳۰۰-۳۰ کلونی را ترجیح می‌دهند .

برای اینکه مطمئن شویم کلونی‌هایی که شمرده شده‌اند ، در این دامنه قرار می‌گیرند ، تلقیح اصلی میکروب‌ها چندین مرتبه طی یک پروسه که serial dilution نامیده می‌شود ، انجام شده و سپس رقیق می‌گردد .

Pour plate & Spread plate :

روش plate count با هر دو روش  pour platet و spread انجام می‌شود . در روش pour plate ، یک میلی لیتر یا ۱/۰ میلی لیتر از رقیق سازی سوسپانسیون باکتریایی به یک پتری دیش منتقل می‌شود . Nutrient medium که در آن آگار از طریق نگهداری در حمام بخار در دمای حدوداً ۵۰ درجه سانتی گراد و به صورت مایع وجود دارد ، بر روی نمونه ریخته می‌شود و سپس با حرکت آرام پلیت مخلوط می‌شود. وقتی که آگار جامد شد ، پلیت در اینکوباتور قرار داده می‌شود .

با تکنیک pour plate ، کلونی‌ها علاوه بر اینکه روی سطح agar plate رشد می‌کنند ، درون nutrient agar هم رشد می‌کنند . این کلونی‌ها از سلول‌هایی که وقتی آگار جامد شد ، در محیط کشت معلق بوده‌اند نشأت می‌گیرند .

این تکنیک دارای نقاط ضعفی است ؛ چون بعضی از میکروارگانسیم‌های نستباً حساس به گرما، توسط آگارِ ذوب شده آسیب می‌بینند و در نتیجه در تشکیل کلونی‌ها ناتوان خواهند ماند . همچنین وقتی که از differential media های خاصی استفاده می‌شود ، ظاهر مشخص کننده‌ی کلونی بر روی سطح برای اهداف تشخیصی ضروری است . کلونی‌هایی که زیر سطح pour plate تشکیل می‌شوند ، برای این گونه تست‌ها مطلوب نیستند .

برای جلوگیری از این مشکلات ، به جای pour plate اغلب از spread plate استفاده می شود . ۱/۰ میلی لیتر از ماده‌ی تلقیحی حاوی باکتری بر روی سطح agar medium منجمد شده و از قبل ریخته شده اضافه می شود . سپس ماده‌ی تلقیحی به طور یکنواخت بر روی سطح محیط به وسیله‌ی میله‌ی شیشه‌ای که دارای شکلی خاص بوده و استریل شده است ، پخش می‌شود . در این روش همه‌ی کلونی‌ها بر روی سطح قرار می‌گیرند و مانع از تماس سلول‌ها با آگار ذوب شده می‌شود .

The Most Probable Number Method (MPN Method) :

روش دیگری برای تعیین تعداد باکتری‌ها در یک نمونه MPN Method است . این تکنیک تخمینی آماری بر اساس این واقعیت است که هرچه تعداد باکتری‌ها در یک نمونه بیشتر باشد ، رقیق سازی بیشتری برای کاهش چگالی تا نقطه ای که هیچ باکتری ای در لوله ی آزمایش باقی نماند که رشد کند ، نیاز است .

روش MPN بیشتر هنگامی مفید واقع می‌شود که میکروبهایی که می‌خواهیم بشماریم، نتوانند بر روی محیط جامد رشد کنند . (مانند باکتری‌های تثبیت کننده ی نیتروژن کمواتوتروف)

این روش همچنین وقتی که رشد باکتری‌ها در محیط differential مایع برای تشخیص میکروب‌ها استفاده می‌شود ، مفید است (مانند باکتری Coliform ، که در تست آب ، به طور انتخابی لاکتوز را به اسید تخمیر می‌کند .) MPN فقط یک بیانیه است که ۹۵ درصد شانس این وجود دارد که جمعیت باکتریایی در یک دامنه ی مشخص کاهش یابد و MPN  از نظر آماری محتمل‌ترین تعداد است .

Direct Microscopic Count :

در روش شمارش مستقیم میکروسکوپی ، یک حجم اندازه‌گیری شده‌ی سوسپانسیون باکتریایی را در یک ناحیه‌ی مشخص از اسلاید میکروسکوپ قرار می‌دهیم .

شمارش باکتری‌های متحرک (motile) با این روش دشوار است و همانطور که در همه‌ی روش‌های میکروسکوپی دیگر وجود دارد سلول‌های مرده نیز مانند سلول‌های زنده شمارش می‌شوند . فایده‌ی مهم شمارش میکروسکوپی این است که هیچ زمان توقف (incubation time) نیاز نیست و معمولاً ویژه‌ی کارهایی است که زمان عامل اصلی باشد .

Estimating Bacterial Numbers by Indirect Methods :

تخمین تعداد باکتری‌ها به وسیله‌ی روش‌های غیر مستقیم :

روش‌های غیر مستقیم تعیین فعالیت و تعداد میکروب‌ها به صورت زیر است :

Turbidity :

برای بعضی از کارهای آزمایشی ، ارزیابی حالت کدری ، یک راه کاربردی برای مشاهده ی رشد باکتریایی است . وقتی در محیط مایع، باکتری‌ها تکثیر می‌شوند ؛ به وسیله‌ی سلول های حاصل محیط، کدر یا تار می‌شود . دستگاهی که برای اندازه‌گیری turbidity استفاده می‌شود ، اسپکتوفتومتر یا رنگ سنج (colorimeter) نام دارد. میزان جذب (absorbance یا optical density  یا OD ) برای رسم نمودار رشد باکتریایی استفاده می‌شود . وقتی باکتری‌ها در رشد لگاریتمی یا کاهشی هستند ، نمودارِ جذب در مقایسه با زمان ، یک خط تقریباً مستقیم خواهد شد . اگر مقادیر جذب را با plate countهای کالچر مشابه مطابقت دهیم ، این رابطه (همبستگی) برای ارزیابی‌های بعدی تعداد باکتری‌ها، با اندازه‌گیری turbidity به دست می‌آید .

Metabolic Activity :

یک روش غیر مستقیم دیگر برای ارزیابی تعداد باکتری‌ها ، اندازه گیری فعالیت متابولیکی یک جمعیت است. در این روش فرض می‌شود که مقادیر محصولات مشخص متابولیکی مانند اسید یا دی اکسیدکربن در رابطه‌ی مستقیم با تعداد باکتری‌های موجود قرار دارند .

Dry weight :

وزن خشک :

برای باکتری‌های رشته‌ای و کپک‌ها ، روش های اندازه‌گیری معمولی از مطلوبیت کمتری برخوردارند . plate count افزایش توده‌های رشته‌ای را نمی‌تواند اندازه‌گیری کند . در plate count های actinomyceteها و کپک‌ها ، اکثراً تعداد اسپورهای غیر جنسی شمارش می‌شوند . این یک اندازه‌گیری مناسب رشد نیست . یکی از راه‌های بهتری که برای اندازه‌گیری رشد ارگانیسم‌های رشته‌ای وجود دارد به وسیله‌ی dry weight  است . در این فرآیند ، قارچ از محیط رشد جدا می‌شود ، فیلتر می شود تا مواد خارجی برطرف شوند و سپس به وسیله‌ی دسیکاتور که وسیله‌ای جاذب الرطوبه است، خشک می شود . بعد از این مرحله وزن می‌شود . برای باکتریها نیز ، فرآیندی مشابه انجام می شود .

محمد مکابر

دانش آموخته صنایع غذایی دانشگاه شیراز و مدیر فوداسپات . امید است این پایگاه بتواند راهگشای دوستان و همکاران عزیز باشد .

مطالب مشابه: